氟譜定量方法
合成工作中氫譜定量大家已經(jīng)很熟悉，使用也比較普遍。但是，氫譜作為一種定量手段有很多缺點(diǎn)：1）氫譜的化學(xué)位移帶寬很窄，大部分集中在0-10 ppm或0-12ppm的范圍；2）各種小分子中都大量含有氫原子，單一樣品或混合樣品測(cè)氫譜的時(shí)候，化學(xué)環(huán)境類似的氫出峰會(huì)有重疊的情況，彼此干擾很大；3）用于藥物測(cè)試時(shí)，藥物的賦形劑也會(huì)影響核磁出峰。
隨著氟化學(xué)的研究深入，現(xiàn)在每年在研的和上市的小分子藥物中有1/3的都含有氟基團(tuán)。利用氟譜做晶型分析、反應(yīng)中控、物料衡算等。
關(guān)于利用核磁氟譜的做含量測(cè)定也越來越受關(guān)注，氟譜定量理論上有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）自然豐度高，穩(wěn)定性好，不像碳會(huì)不斷衰變，自旋量子數(shù)1/2；2）氟譜對(duì)電子環(huán)境變化敏感，化學(xué)位移帶寬超過200ppm，不會(huì)像氫譜那樣擁擠在一個(gè)狹小的區(qū)間；3）一般無關(guān)的雜質(zhì)、藥物賦形劑中不含氟，對(duì)目標(biāo)物的干擾?。?）樣品檢測(cè)需求量也很小，<mg級(jí)都可以測(cè)。
氟譜定量的測(cè)定方法和參數(shù)設(shè)定討論：
1. T1弛豫（或縱向弛豫）
90°磁化角（Tip angle）具有最佳的信噪比（S/N）:
2. 測(cè)試時(shí)間
一般情況下，當(dāng)設(shè)置測(cè)試時(shí)間為5倍的弛豫時(shí)間時(shí)，99.33%的弛豫信號(hào)（激發(fā)態(tài)回到基態(tài)過程中釋放的能量信號(hào)）就可以被收集到。當(dāng)測(cè)試時(shí)間設(shè)置為8倍弛豫時(shí)間信號(hào)采集率可以達(dá)到99.97%。比如，一個(gè)分子的弛豫時(shí)間為1.1s, 弛豫延遲設(shè)置為8.25s，采樣時(shí)間1.75，那總的測(cè)試時(shí)間應(yīng)該就是10s。
3. 采樣時(shí)間
采樣時(shí)間一般是目標(biāo)產(chǎn)物半峰高線寬的倒數(shù)，比如一個(gè)目標(biāo)峰的19F線寬是0.5Hz,采樣時(shí)間應(yīng)設(shè)置為2-2.5s為宜。采樣時(shí)間不是越長越好，有效的采樣時(shí)間可以在信號(hào)完全衰減之前盡量收集到有效的衰減信號(hào)，當(dāng)信號(hào)完全衰減以后，繼續(xù)接受到的無效信號(hào)就是噪音了，S/N會(huì)降低。
4. 信噪比
一般要求信噪比必須大于150/1才能將檢測(cè)的不確定性降低到<1%。
5. 激發(fā)帶寬
前面我們討論過，氫譜的激發(fā)帶寬一般在0-10ppm或0-12ppm，而氟譜的激發(fā)帶寬則可以達(dá)到200ppm。但是，核磁的磁化探頭受到功率限制，是不可能在如此大的帶寬上實(shí)現(xiàn)均勻激發(fā)的。一般有四種方法解決這個(gè)問題：1）發(fā)射器頻率設(shè)置在目標(biāo)峰的激發(fā)頻率附近；2）生成多個(gè)圖譜；3）縮短激發(fā)脈沖的發(fā)射時(shí)間，增加帶寬，但是這會(huì)犧牲信噪比。4）使用異型波（CHORUS）,有一個(gè)前提是底物在異型波的作用下沒有很強(qiáng)的JFF耦合。
6. 瞬態(tài)數(shù)
從一個(gè)方向上收集單個(gè)瞬態(tài)的信號(hào)，可以降低弛豫時(shí)間的誤差，但是信號(hào)會(huì)比較弱，通過多個(gè)瞬態(tài)數(shù)據(jù)的疊加可以大大提高信噪比。瞬態(tài)的數(shù)量稱為瞬態(tài)數(shù)n。S/N是關(guān)于n2的函數(shù)，即瞬態(tài)數(shù)越多信噪比越大。（貌似可以通過增加樣品濃度提高n）。
7. 傅里葉數(shù)
比如，我們的測(cè)試頻率是100MHZ,在10us的時(shí)間里采集了有1000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，那么頻域范圍如下：
直接進(jìn)行傅里葉變換，得到如下圖形：
因?yàn)閰⑴c傅里葉變換的點(diǎn)數(shù)較少，變換后的圖形明顯點(diǎn)數(shù)過于稀松，這時(shí)候就會(huì)使用“補(bǔ)零”的方法，把數(shù)據(jù)點(diǎn)壓縮在一個(gè)更小的讀取窗口里，讓更多的數(shù)據(jù)點(diǎn)參與傅里葉變換。這樣，在沒有增加采樣點(diǎn)和設(shè)備發(fā)射頻率的情況下就能讓取樣點(diǎn)更加集中。下圖是添加了7000個(gè)0點(diǎn)以后的圖形。
在進(jìn)行傅里葉變換，圖形就平滑了很多，但是這只是數(shù)字上游戲，騙騙眼睛，對(duì)于分真實(shí)的核磁分辨率根本沒有任何提高。就像你從近處看紅綠燈是由多個(gè)小LED燈組成，他們組成的圓形，邊緣很不光滑成鋸齒狀。然后你就往后退了100米（就是所謂的補(bǔ)零），眼睛再處理這個(gè)圖形的時(shí)候，紅綠燈的形狀變成了一個(gè)規(guī)則的圓形。所以紅綠燈沒變，LED點(diǎn)數(shù)沒有變，“補(bǔ)零”讓你更加“全局”的觀測(cè)紅綠燈的形狀而已。
要想正真的提高核磁分辨率，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，最有效的方法還是提高核磁頻率，單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射更多的脈沖波或者延長采樣時(shí)間，采集更多的數(shù)據(jù)點(diǎn)。下圖是延長采樣時(shí)間以后，在80us的時(shí)間里采集了8000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，那么頻域范圍如下：
在進(jìn)行傅里葉變換，圖形的分辨率得到了根本的提升。所以，要想獲得更好、更可靠的核磁數(shù)據(jù)，沒有捷徑，要么花錢更新設(shè)備提高頻率、要么花時(shí)間增加采樣點(diǎn)。
8. 氟譜定量的具體方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法：
所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線法還是要借助特定量的內(nèi)標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的積分值和樣品濃度之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將待測(cè)樣品的積分值代入擬合公式計(jì)算得到待測(cè)樣品的含量。如，下圖是以三氟乙酸為內(nèi)標(biāo)（積分值100），檢測(cè)鹽酸氟西汀含量的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，每一個(gè)樣品中的三氟乙酸都是等量的，標(biāo)品含量從0-2.0mmol/L不等，繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合度高達(dá)99.9%（也就是擬合公式的可信度高達(dá)99.9%）。
需要注意的是，1）不是所有的含氟分子都適合做內(nèi)標(biāo)，肯定不能選用與底物反應(yīng)的含氟內(nèi)標(biāo)；2）樣品中內(nèi)標(biāo)的mol濃度和待測(cè)樣品要接近，便于積分，減小誤差；3）內(nèi)標(biāo)和樣品的氟信號(hào)出峰位置應(yīng)該盡量接近一些（選取相近的氟基團(tuán)種類：三氟甲基找三氟甲基、氟苯找氟苯等等）。
找到規(guī)律以后，確定某種內(nèi)標(biāo)（比如三氟乙酸）具有普遍的適用性，也可以也不用每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，嘗試直接加內(nèi)標(biāo)定量，多送幾個(gè)平行樣確認(rèn)就可以了。
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